Os pacientes com RA foram recrutados do ambulatório do Hospital Zhujiang, Southern Medical University (Guangzhou, China) de janeiro de 2014 a junho de 2015. Os participantes foram selecionados através da história clínica e avaliações de sintomas alérgicos com base nos critérios de inclusão e exclusão, padronizados de acordo com uma diretriz relatada anteriormente.11

Os critérios de inclusão foram os seguintes: 1) Idade de 18‐65 anos, com história de RA havia pelo menos um ano; 2) Pelo menos três dos quatro principais sintomas (espirros, secreção nasal clara, obstrução nasal e prurido nasal), esses sintomas deveriam ter um tempo cumulativo > 0,5‐1h de duração por dia para os participantes com RA perene (RAP); 3) Edema e obstrução da mucosa nasal (ou até mesmo das pálpebras); e 4) Reação positiva a pelo menos um dos testes alérgicos de punctura cutânea, com um escore no índice de teste de alergia cutânea que não superior a ++ ou +++.

Os critérios de exclusão foram os seguintes: 1) Existência de infecção do trato respiratório e rinossinusite suborbital infecciosa; 2) Presença de asma alérgica, com ataque asmático nos últimos 5 anos; 3) Existência de rinite não alérgica (a condição na qual o alérgeno causador não foi confirmado, por exemplo, rinite vasomotora); 4) Presença de desvio grave do septo nasal ou pólipos nasais; 5) uso de anti‐histamínico (por exemplo, loratadina) ou descontinuação de corticosteroide num período < 4 semanas; 6) descontinuação de astemizol havia < 6 semanas e descontinuação de outros medicamentos anti‐histamínicos havia menos de uma semana; 7) tempo de descontinuação < 1 semana para anti‐histamínicos administrados via nasal, sprays nasais de glicocorticoides ou medicamentos administrados através de gotas nasais; e 8) Uso de antibióticos macrolídeos e/ou agentes antifúngicos imidazólicos.

O protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Zhujiang Hospital, Southern Medical University, e todos os participantes forneceram consentimento informado por escrito. Além disso, este estudo foi conduzido de acordo com os regulamentos do comitê de ética em pesquisa clínica e da World Medical Association e os princípios da Declaração de Helsinque (Registro Clínico número: 2013‐EBYHK‐004).

Foram incluídos neste estudo 108 participantes (62 homens e 46 mulheres) com média de 37 anos. Trinta e seis participantes (20 homens e 16 mulheres) com uma média de 36 anos foram submetidos a avaliação física no centro de exame do Hospital Zhujiang, os quais foi então incluídos como controles saudáveis.

Os escores de espirros e obstrução nasal de todos os participantes foram obtidos, os quais foram usados para o agrupamento do tratamento, usaram‐se ‐se os escores da escala visual analógica (EVA) que são baseados na gravidade dos sintomas (tabela 1). Como mostrado na figura 1, todos os participantes foram classificados em três grupos, com base no escore da EVA dos sintomas, combinado com os níveis de histamina e leucotrieno D4. Os 108 participantes foram divididos em grupo de espirros (33 participantes, 31%), de obstrução nasal (37 participantes, 34%) e misto (38 participantes, 35%). Posteriormente, os três grupos de sintomas foram subdivididos em quatro subgrupos, baseados nos medicamentos que receberam.

Figura 1.

Ilustração esquemática do agrupamento de tratamento de participantes com RA.

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Neste estudo, os pacientes com RA usaram loratadina, montelucaste e furoato de mometasona. Os participantes receberam aleatoriamente 10mg de loratadina e montelucaste (uma dose por dia) e 50 μg de furoato de mometasona (uma dose do spray em cada narina, uma vez ao dia).

O sangue venoso e as secreções nasais dos participantes com RA e dos controles saudáveis foram obtidos para determinar os níveis de histamina e leucotrieno D4, usou‐se ensaio imunoenzimático (ELISA) tipo duplo sanduíche. O kit ELISA foi adquirido da Shanghai BlueGene Biotech Co., Ltd. (Xangai, China) e os ensaios foram feitos de acordo com as instruções do fabricante cp um sistema Synergy HT Multimode Reader (BioTek, Winooski, VT, EUA).

As amostras da mucosa das conchas nasais dos participantes com RA e daqueles que foram submetidos a cirurgia do septo nasal, que foram incluídos como controles saudáveis, foram examinadas para caracterizar as expressões gênica e proteica dos receptores de H1 e CysLT1. Foi feita uma reação de polimerase em cadeia fluorescente quantitativa (QF‐PCR) em tempo real para analisar a expressão de mRNA dos receptores de H1 e CysLT1. Todos os oligonucleotídeos purificados através de cromatografia líquida de alta performance foram quimicamente sintetizados pela Invitrogen Biotechnology Co. Ltd. (Xangai, China). Os primers F1 (CCTGGATACCGCAGCTAGGA) e R1 (GCGGCGCAATACGAATGCCCC) foram usados para a amplificação de 18SrRNA (GenBank ID: NR 003286) como referência interna. Enquanto isso, os primers F2 (TACGGAGTGAGCGGAAGC) e R2 (GCAGGTAGAGGATGTTCATAGG) foram usados para a amplificação de HRH1 (GenBank ID: NM 000861.3). Além disso, os primers F3 (GCCATGAGCTTTTTCCGGTG) e R3 (TGATTGTCTTGTGGGGGCTC) foram usados para a amplificação de CysLT1 (GenBank ID: AF 119711.1). O sistema de reação de transcrição reversa para a síntese de cDNA foi preparado com base nas instruções do fabricante para o uso do GoScript® Reverse Transcription System. A reação de polimerase em cadeia quantitativa (qPCR) foi feita com o sistema ABI7500 qPCR Thermocycle Instrument em tempo real (ABI, Vernon, CA, EUA), com o cDNA como template do FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche, Indianapolis, IN, EUA) e β‐actina como controle, de acordo com as instruções do fabricante. Os valores médios do limiar do ciclo (CT, do inglês cycle threshold) para as três reações de PCR foram determinados e calculados como fold change sobre as amostras de controle, usou‐se o método ΔCT comparativo para calcular as alterações no nível de expressão gênica.

A expressão proteica dos receptores de H1 e CysLT1 foi avaliada através de ensaio de Western blotting. Além disso, uma análise semiquantitativa de quimiluminescência (QL) foi feita com o software Image Lab após uma varredura em escala de cinza do filme de raios‐X. A QL média para três casos foi determinada e calculada como a QL relativa sobre as amostras de controle para calcular as mudanças no nível de expressão da proteína. A expressão proteica dos receptores de H1 e CysLT1 foi quantificada através de comparações com β‐actina e γ‐tubulina, respectivamente.

O escore total de sintomas nasais (TNSS, do inglês Total Nasal Symptom Score) foi calculado como a soma dos escores dos quatro sintomas nasais (rinorreia, prurido nasal, obstrução nasal e espirros), que foram avaliados através de uma escala Likert de quatro pontos com base na gravidade dos sintomas (tabela 2), de acordo com o protocolo de um estudo anterior.11 Os escores dos sintomas nasais individuais foram registrados nos ambulatórios e por contato telefônico com os participantes, feitos no dia da consulta e 2, 4 e 8 semanas após a terapia medicamentosa. O índice de redução do escore de sintomas nasais totais (TNSSRI), o índice de redução (IR) do escore de espirros e o IR do escore de obstrução nasal foram usados para avaliar a eficácia do tratamento clínico, onde IR = (escore pré‐tratamento ‐ escore pós‐tratamento)/escore pré‐tratamento. Além disso, os níveis de histamina e leucotrieno D4 no sangue periférico e nas secreções nasais, juntamente com as alterações nos níveis de expressão de mRNA e proteína dos receptores de H1 e CysLT1 nas amostras da mucosa das conchas nasais, foram usados para avaliar o efeito clínico curativo.

As correlações entre o escore de sintomas nasais isolados (escores de espirros e obstrução nasal) e os níveis de histamina e leucotrieno D4 no sangue periférico e nas secreções nasais foram avaliadas pelo teste de correlação de Pearson. Um teste t para amostras independentes foi feito para determinar o IR do escore de sintomas nasais isoladamente e os níveis de histamina e leucotrieno D4 antes e após o tratamento e avaliar a validade dos efeitos pré e pós‐medicação para cada grupo. Além disso, um teste t de amostras pareadas foi feito para calcular o TNSSRI dos participantes com RA após 2, 4 e 8 semanas de tratamento. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significante. Todos os dados foram apresentados como Ā ± S, onde Ā e S referem‐se ao valor médio e desvio‐padrão da média, respectivamente. Todas as análises estatísticas foram feitas com o software SPSS versão 19.0 (IBM Co., Armonk, NY, EUA).

A figura 2 apresenta o estado clínico da RA dos participantes dos grupos espirros (n = 33), obstrução nasal (n = 37) e misto (n = 38) antes do tratamento, de acordo com os escores TNSS, espirros e obstrução nasal. Os parâmetros do TNSS dos três grupos de sintomas não foram estatisticamente significantes (p > 0,05). Os grupos espirros e misto apresentaram escores de espirros significantemente mais elevados do que o grupo com obstrução nasal (p < 0,05). O grupo com obstrução nasal e o grupo o misto tiveram escores de obstrução nasal significantemente mais elevados do que o grupo espirros (p < 0,05). A tabela 3 apresenta os níveis médios de histamina e leucotrieno D4 no sangue periférico e nas secreções nasais dos participantes com RA dos três grupos. O TNSS e os níveis de histamina e leucotrieno D4 dos três grupos de sintomas mostraram correlações acentuadamente positivas (p < 0,001). A tabela 4 apresenta as correlações entre os escores de sintomas nasais isoladamente e os níveis de histamina e leucotrieno D4 no sangue periférico e nas secreções nasais. Uma relação positiva foi observada entre os escores da EVA de espirros e os níveis de histamina no sangue periférico e nas secreções nasais dos participantes com RA dos grupos espirros, obstrução nasal e grupo misto (r = 0,43/0,43, 0,60/0,61 e 0,83/0,82, respectivamente, p < 0,05). De maneira similar, correlações altamente positivas também foram encontradas entre o escore da EVA de obstrução nasal e os níveis de leucotrieno D4 dos grupos espirros, obstrução nasal e misto (r = 0,54/0,50, 0,56/0,55 e 0,61/0,60, respectivamente; p < 0,05).

Figura 2.

Escore total de sintomas nasais e escores dos sintomas nasais isoladamente dos pacientes com RA dos grupos, espirros (n = 33), grupo nasal (n = 37) e grupo misto (n = 38) antes do tratamento.

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A figura 3 mostra o TNSSRI após o tratamento dos grupos espirros, obstrução nasal e misto. Para o grupo espirros (fig. 3A), as combinações loratadina + furoato de mometasona e loratadina + montelucaste + furoato de mometasona mostraram um TNSS significativamente menor do que a monoterapia com loratadina e a terapia combinada de montelucaste + furoato de mometasona após um período específico de administração da medicação (p < 0,05). Para o grupo com obstrução nasal (fig. 3B), ambas as terapias combinadas de montelucaste + furoato de mometasona e loratadina + montelucaste + furoato de mometasona resultaram em um TNSS significantemente menor do que a monoterapia com montelucaste e a terapia combinada de loratadina + furoato de mometasona (p < 0,05). Já para o grupo misto (fig. 3C), a terapia combinada de loratadina + montelucaste + furoato de mometasona resultou em um TNSS significantemente menor do que as terapias combinadas de loratadina + montelucaste, loratadina + furoato de mometasona e montelucaste + furoato de mometasona (p < 0,05).

Figura 3.

Índice de redução do escore de sintomas nasais total (TNSSRI) de participantes com RA para (A) grupo espirros, (B) grupo obstrução nasal e (C) grupo misto após 2, 4 e 8 semanas de medicação.

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A figura 4 mostra o IR dos vários parâmetros clínicos, como os escores de espirros e obstrução nasal e os níveis de histamina e leucotrieno D4 no sangue periférico e nas secreções nasais, após o tratamento dos grupos espirros, obstrução nasal e misto. Resumidamente, para o grupo espirros (fig. 4A), as terapias combinadas de loratadina + furoato de mometasona e de loratadina + montelucaste + furoato de mometasona melhoraram significantemente o sintoma de espirro e reduziram os níveis de histamina no sangue periférico e nas secreções nasais em comparação com a monoterapia de loratadina (p < 0,05) e terapia combinada de montelucaste + furoato de mometasona (p < 0,05). Além disso, ambas as terapias combinadas, montelucaste + furoato de mometasona e loratadina + montelucaste + furoato de mometasona, melhoraram significantemente os sintomas de obstrução nasal e diminuíram os níveis de leucotrieno D4 no sangue periférico e nas secreções nasais em comparação com a monoterapia com loratadina (p < 0,01) e terapia combinada de loratadina + furoato de mometasona (p < 0,05). Para o grupo com obstrução nasal (fig. 4B), as terapias combinadas de loratadina + furoato de mometasona, de montelucaste + furoato de mometasona e de loratadina + montelucaste + furoato de mometasona melhoraram significantemente o sintoma espirros e reduziram os níveis de histamina no sangue periférico e nas secreções nasais em comparação à monoterapia com loratadina (p < 0,05). Além disso, ambas as terapias combinadas, montelucaste + furoato de mometasona, e loratadina + montelucaste + furoato de mometasona melhoraram significantemente o sintoma obstrução nasal e reduziram os níveis de leucotrieno D4 no sangue periférico e nas secreções nasais em comparação à monoterapia com montelucaste (p < 0,05) e terapia combinada de loratadina + furoato de mometasona (p < 0,05). Para o grupo misto (fig. 4C), ambas as terapias combinadas de loratadina + furoato de mometasona e de loratadina + montelucaste + furoato de mometasona melhoraram significantemente o sintoma espirros e reduziram os níveis de histamina no sangue periférico e secreções nasais em comparação às terapias combinadas de loratadina + montelucaste e de montelucaste + furoato de mometasona (p < 0,05). Além disso, as terapias combinadas de montelucaste + furoato de mometasona e de loratadina + montelucaste + furoato de mometasona melhoraram significantemente o sintoma obstrução nasal e diminuíram os níveis de leucotrieno D4 no sangue periférico e nas secreções nasais em comparação com as terapias combinadas de loratadina + montelucaste e de loratadina + furoato de mometasona (p < 0,05).

Figura 4.

Índice de redução do escore de espirros, obstrução nasal e níveis de histamina e leucotrieno D4 no sangue periférico e secreções nasais de pacientes com RA para (A) grupo espirros, (B) grupo obstrução nasal e (C) grupo misto após 4 semanas de medicação. EE, escore de espirros; ON, escore de obstrução nasal; His em SP, nível de histamina no sangue periférico, His em SN, nível de histamina nas secreções nasais, LTD4 em SP, nível de leucotrieno D4 no sangue periférico; LTD4 em SN, significa nível de leucotrieno D4 nas secreções nasais.

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A figura 5 apresenta as mudanças nos níveis de expressão gênica e proteica antes e após a medicação. Os participantes com RA tiveram níveis significantemente mais baixos de expressão de RNAm e proteína dos receptores de H1 e CysLT1 após a terapia medicamentosa do que antes do tratamento (p < 0,05), embora não tenha havido diferença estatisticamente significante (p > 0,05) entre os participantes e controles saudáveis.

Figura 5.

Detecção da expressão gênica e dos níveis de expressão proteica dos receptores de histamina H1 e leucotrieno CysLT1 de participantes antes e após a medicação. A, Quantificação dos níveis de mRNA dos receptores de histamina H1 e leucotrieno CysLT1 analisados por qPCR. B, Quantificação dos níveis de proteína dos receptores de histamina H1 e leucotrieno CysLT1 analisados por Western Blot. C, Imagens de Western Blot das proteínas de histamina H1, leucotrieno CysLT1 e controle. Antes do tratamento: faixas 1, 2, 3; pós‐tratamento: faixas 4, 5, 6 e controle saudável: Faixas 7, 8. β‐actina e γ‐tubulina foram respectivamente usados como controle para os receptores de histamina H1 e leucotrieno CysLT1 em qPCR e Western Blot.

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