As células progenitoras da orelha interna usadas neste estudo foram fornecidas pelo laboratório da University of Minnesota, que é uma linhagem celular de células epiteliais sensoriais auditivas de camundongo, inicialmente estabelecida em 2003 por Ozeki et al.,9 que tem potencial de diferenciação multidirecional18 e homologia relativamente alta com as células auditivas cocleares.

As células progenitoras da orelha interna foram primeiramente removidas de um tubo de criopreservação (University of Minnesota, Minnesota, EUA) e cultivadas em meio que consistiu em DMEM/F12 (Hyclone, Chicago, EUA) + 1% de N2 (Peprotech, New Jersey, EUA) + EGF (10 ng/mL) (Peprotech, New Jersey, EUA) + Bfgf (10 ng/mL) (Peprotech, New Jersey, EUA), o meio de cultura foi trocado em dias intercalados. Um microscópio invertido Nikon (Nikon, Xangai, China) foi usado para observar a morfologia celular e o status de crescimento e a expressão de nestina nas células foi detectada com o método imunoquímico celular. Amostras das células em bom estado de crescimento foram então obtidas, lavadas com PBS e divididas em grupo experimental (EXP) e grupo controle (CON) para posterior cultivo em placas de 12 poços. As células do grupo EXP foram induzidas com DMEM/F12+AR (10–6M) (Sigma, EUA) e as células do grupo CON foram cultivadas com DMEM/F12 + DMSO (0,11mg/mL) (Sigma, EUA); o meio era trocado todos os dias. Após 3 dias, as expressões das proteínas marcadoras de células ciliadas Math1 e Myosin VIIa foram detectadas com citoquímica por imunofluorescência.

Após aspirar o meio de cultura celular, o resíduo foi enxaguado com PBS 3 vezes *2min, seguido de secagem do líquido residual, fixação em 100μL de paraformaldeído a 4% por 20min, enxágue com PBS 3 vezes *2min, secagem, 15min de perfuração da membrana celular com 100μL de solução de Triton a 0,3%, enxágue com PBS 3 vezes *2min e secagem; 100μL de soro de cabra a 10% foram então adicionados para bloqueio de 30min a 37°C; o soro de cabra foi então removido (sem enxágue); 100μL de nestina anticamundongo produzida em coelho (Bioss, Pequim, China) (diluição 1:100) foram então adicionados para cultura durante a noite a 4°C em um umidificador (PBS foi adicionado para contraste no grupo CON); após a mistura ter sido reaquecida no dia seguinte por 45min, ela foi enxaguada com PBS 3 vezes *2min, seguido por secagem, 15min de cultura com 100μL de polímero adjuvante a 37°C, enxágue com PBS 3 vezes *2min, secagem, 15min de cultura com 100 uL de IgG anticoelho de cabra marcado com HRP (Nakasugi Jinqiao, Pequim, China) a 37°C, enxágue com PBS 3 vezes *2min, secagem, 5min. de cultura com 100μL de solução DAB no escuro em temperatura ambiente, enxágue com água da torneira, secagem, coloração de 2min com 100μL de solução de hematoxilina, enxágue com água destilada, secagem e observação em microscópio invertido.

O reagente trizol foi usado para extrair o RNA total. Foi detectada a concentração e pureza através de um leitor de microplacas. A pureza do RNA total foi OD> 1,8 e a integridade do RNA foi detectada por eletroforese em gel de agarose de RNA. O RNA total foi então transcrito reversamente em cDNA com um kit de transcrição reversa, seguido de amplificação por PCR. Os primers foram sintetizados por Shanghai Shengong.

Primers:

Math1(269bp): upstream: 5,‐CCAGGGTGAGCTGGTAAGG‐3; downstream: 5,‐CGTTGTTGAAGGACGGGAT‐3; Myosin7a(628bp): upstream: 5,‐AAGCACCTGCTCCTGCTCGTCCACG‐3; downstream: 5,‐CTCCCTCTACATCGCTCTGTTCG‐3, GAPDH (462bp): upstream: 5,‐TGCTGTCCCTGTATGCCTCT‐3, downstream: 5,‐GGTCTTTACGGATGTCAACG‐3.

As condições da reação de PCR foram as seguintes: Math1: pré‐desnaturação a 94° C por 5min, desnaturação a 94° C por 30s, annealing a 59,8° C por 30s, 72°C por 30s e extensão dos primers a 72° C por 5‐ min, para 40 ciclos. As condições de reação de Myosin7a e GAPDH foram iguais às de Math1, mas as temperaturas de annealing foram 64° C e 57° C, respectivamente.

Os resultados da eletroforese foram observados com um revelador de imagem em gel.

As células em bom estado de crescimento foram colhidas, lavadas com PBS, divididas em grupo EXP e grupo CON e então cultivadas em placas de 12 poços. As células do grupo EXP foram induzidas com DMEM/F12 + RA (10‐6M) e as do grupo CON foram tratadas com DMEM/F12 + DMSO (0,11mg/mL); o meio era trocado todos os dias. Após 3 dias, as expressões das proteínas marcadoras de células ciliadas (Math1 e MyosinVIIa) foram detectadas com citoquímica por imunofluorescência. Os procedimentos foram os seguintes: após a remoção do meio de cultura de células, as células foram enxaguadas com PBS 3 vezes *2min, seguido de fixação de 20min com 100 uL de paraformaldeído a 4%, enxágue com PBS 3 vezes *2min, perfuração da membrana celular de 15min com 100μL de solução de Triton a 0,3%, enxágue com PBS 3 vezes *2min; 100μL de soro de cabra a 10% foram então adicionados para bloqueio por 30min a 37°C; o soro de cabra foi então removido (sem enxágue); 80μL de anticamundongo Math1 produzido em coelho (Sigma, EUA) (diluição 1:100) e 80μL de anti‐camundongo Myosin7a produzido em coelho foram então adicionados para cultura durante a noite a 4°C em um umidificador (PBS foi adicionado ao grupo CON para contraste); após a mistura ter sido reaquecida no dia seguinte por 45min, ela foi enxaguada com PBS 3 vezes *2min. Todas as operações devem ser feitas no escuro. Mais tarde, foram adicionadas às células 100μL de IgG anticoelho de cabra marcado com Tric, gota a gota (ZSGB‐BIO, Pequim, China) para incubação de 30min a 37° C, seguido de enxágue com PBS 3 vezes *2min, 2 minutos de incubação com solução DAPI em temperatura ambiente (no escuro), enxágue com PBS 3 vezes * 2min e observação sob um microscópio invertido fluorescente. Cinco campos visuais independentes foram selecionados para contagem de células em cada grupo e a taxa de células positivas foi calculada para análise estatística.

A suspensão de células (a uma concentração de 106 células/mL) foi inoculada em uma placa de 6 poços por um dia. No dia seguinte, as células aderidas à parede foram colhidas e divididas em três grupos: experimental (AR), controle negativo (Ctrl‐) e controle positivo (Ctrl+). O Grupo AR foi cultivado com DMEM/F12 + AR (10–6M) + Brdu (10μg/mL), o Grupo Ctrl‐ foi cultivado em DMEM/F12 + DMSO (0,11mL/mL) + Brdu (10μg/mL), e o grupo Ctrl + foi cultivado em DMEM/F12 + FBS 10% + Brdu (10μg/mL); a cultura durou 48h, o meio de cultura foi trocado todos os dias. O teste imunoquímico celular foi feito após 2 dias. O método de imuno‐histoquímica foi o mesmo da nestina: desnaturação do ácido nucléico com HCl antes de adicionar o peróxido. O anticorpo primário foi anti‐BrdU de camundongo (Sigma, EUA) (diluição 1:40) e o anticorpo secundário foi anti‐IgG de camundongo marcado com HRP (ZSGB‐BIO, Pequim, China). Os resultados foram observados em microscópio invertido. Seis campos visuais independentes foram selecionados em cada grupo para contagem de células e a taxa de células Brdu + foi calculada para análise estatística.

Os resultados foram expressos como x¯ ±s e a análise estatística foi feita com o software SPSS17.0. As diferenças entre os grupos foram analisadas por one‐way Anova. O método LED (L) foi usado quando a variância era homogênea e o método T3 de Dunnett foi usado quando a variância era não homogênea. A diferença foi considerada estatisticamente significante quando p <0,05. O software GraphPad Prism 5 foi usado para o mapeamento.

Após o descongelamento, as CPNs encolheram até virar pequenas células esféricas e ficaram aderidas à parede da placa de cultura por cerca de meia hora após a inoculação. As células morreram e flutuaram na superfície do meio após 24h. Todas as células sobreviventes exibiram aderência à parede. O formato da célula era relativamente simples e, na sua maioria, fusiforme. Algumas células exibiram algumas protrusões celulares (fig. 1A). Após 48h, as morfologias celulares se diversificaram, exibiram formatos ovais, fusiformes (principalmente) ou poligonais. As protrusões celulares aumentaram ainda mais (fig. 1B).

Figura 1.

A, 24h após passagem das CPNs. B, 48h após passagem das CPNs (× 200). A morfologia celular das CPNs após 24h e 48h de cultivo em microscópio invertido.

(0,14MB).

Nas CPNs, o marcador de células‐tronco neurais foi expresso positivamente. As células progenitoras do ouvido interno eram indiferenciadas, pertencentes às células‐tronco neurais e favoráveis à indução da diferenciação (fig. 2).

Figura 2.

Detecção de nestina em CPNs (coloração imunoquímica celular) (× 200). A, Grupo EXP para detecção de nestina em CPNs e B, Grupo CON. A, Identificação da expressão de nestina em CPNs por coloração imunoquímica celular. A coloração está no citoplasma. A coloração positiva é amarelo‐acastanhado e a negativa não exibe coloração. B, Coloração dos núcleos das CPNs e os núcleos são corados de azul com hematoxilina.

(0,2MB).

As taxas de células positivas para Math1 no grupo CON e no grupo EXP foram de 1,5% e 63% (figs. 4 A e C), respectivamente, e as taxas de células positivas para MyosinVIIa no grupo CON e no grupo EXP foram de 0,96% e 56% (figs. 4 B e C), respectivamente, com p <0,05, indicaram que o AR exógeno promove a formação das proteínas Math1 e Myosin?a em CPNs, de modo que as CPNs podem gradualmente se diferenciar em células ciliadas.

Figura 4.

A, Coloração por imunofluorescência com Math1 em CPNs após indução de diferenciação (×200). (a e d) são coloração com Math1 (os núcleos corados exibem fluorescência vermelha); (b e e) são núcleos corados com DAPI (os núcleos corados exibem fluorescência azul); (c e f) combinam as duas primeiras imagens. B, Coloração por imunofluorescência com Myosin?a em CPNs após indução de diferenciação. (a e d) são coloração com Myosin?a (o citoplasma corado exibe fluorescência vermelha); (b e e) núcleos corados com DAPI (os núcleos corados exibem fluorescência azul); (c e f) combinam as duas primeiras imagens. C, Proporção de marcadores de células ciliadas coradas positivamente em CPNs após indução de diferenciação.

(0,17MB).

Os núcleos das células positivas exibiram partículas marrons e os núcleos foram corados de azul com hematoxilina (fig. 5A).

Figura 5.

A, Teste Brdu de CPNs (coloração imunoquímica celular) (×400). Teste Brdu de CPNs, (a) Grupo ctrl‐; (b) Grupo RA; (c) Grupo ctrl+. Os núcleos das células positivas exibiram partículas marrons e os núcleos foram corados em azul com hematoxilina. B, Razão de células Brdu + em CPNs.

Brdu‐positive cell rate of cochlear neural progenitor cells=Taxa de células positivas para Brdu de células progenitoras neurais cocleares.

(0,23MB).

As taxas de coloração de células Brdu + no grupo AR, grupo ctrl‐ e grupo ctrl + foram 20,6%, 29,9% e 54,3%, respectivamente, com p <0,05, indicaram significância estatística entre os três grupos (fig. 5B).