O estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa e aprovado sob o número 2011‐3. Um veterinário acompanhou todos os procedimentos feitos em animais. Foram seguidas diretrizes institucionais referentes à experimentação animal.

Foram estudados 180 coelhos Nova Zelândia adultos brancos, de ambos os sexos, com aproximadamente 2.500g no início da experiência. Ao longo do estudo, os animais foram confinados em gaiolas individuais adequadas para raça e peso.

Os animais foram divididos em três grupos. Um grupo foi avaliado em relação ao uso terapêutica de Luffa operculata. Esse grupo foi acompanhado por três períodos. Outro grupo não foi tratado com Luffa operculata (grupo controle) e, finalmente, um terceiro grupo recebeu Luffa operculata para avaliar sua toxicidade. Portanto, cada grupo tinha 20 animais para cada tempo de seguimento. Assim, foram avaliados animais para o grupo terapêutico (n=60), 60 para o grupo controle e 60 para o grupo de toxicidade.

Os coelhos foram submetidos a um procedimento cirúrgico sob anestesia geral para gerar um processo inflamatório nasal, semelhante à RS infecciosa aguda. Inicialmente, uma esponja porosa de polivinil com 3,0×0,5×0,3cm foi esterilizada em óxido de etileno e depois introduzida em uma cavidade nasal de cada animal.

Um mL de uma solução composta de 0,8mL de sangue animal e 0,2mL de toxoide estreptocócico e estafilocócico (Toxoidepot®) foram injetados por via percutânea no antro maxilar no mesmo lado em que a esponja foi introduzida. As esponjas foram mantidas na cavidade nasal de cada animal por dez dias, após o qual as esponjas foram removidas e deu‐se início à fase de tratamento. Quando a esponja foi removida da cavidade nasal e antes do início do tratamento cada animal teve a secreção da cavidade nasal coletada por cotonete (Culturette®). Amostras das secreções sinusais foram semeadas em meio de cultura de ágar‐sangue e ágar‐chocolate (Probac do Brasil). As placas com agar‐sangue e agar‐chocolate foram incubadas a 35°±2° C, com leitura em 48 horas.

Com solução salina fisiológica como solvente, preparou‐se uma diluição com 0,1g de extrato aquoso de Luffa operculata em 10mL de solução salina para se obter a concentração esperada. A solução foi colocada em um atomizador (fig. 1), que produziu um jato da mistura em um bico de spray, resultou na formação de aerossol microparticulado. Cada jato aplicava 0,5mL de solução.

Figura 1.

Atomizador usado na aplicação da substância.

(0,14MB).

Após o período de indução da RS, os animais do grupo de estudo terapêutico receberam tratamento com aplicação nasal de extrato aquoso de Luffa operculata diluído a 1% em solução salina. A cabeça do animal foi mantida na posição vertical e o bico do atomizador foi inserido na narina direita. O bico atomizador foi pressionado uma vez. Em seguida, o dispositivo foi limpo e o processo foi repetido na narina esquerda. Os animais receberam um spray da solução, três vezes ao dia durante todo o período de tratamento. O grupo controle recebeu tratamento com solução salina na mesma forma e quantidade do grupo de estudo durante 30 dias. Após cinco dias de tratamento, 20 animais de cada grupo foram sacrificados. O mesmo procedimento foi repetido após 15 dias e após 30 dias.

Imediatamente após a eutanásia, foram coletadas amostras da mucosa de revestimento do seio maxilar. Os parâmetros histológicos observados foram infiltração de células inflamatórias (infiltrado leve, moderado ou grave), neovascularização (presente ou ausente) e proliferação conjuntivo‐fibrosa (ausência em surtos isolados ou proliferação difusa). Todas as lâminas foram avaliadas por dois patologistas diferentes, cegos ao protocolo de tratamento.

Foram divididos 60 coelhos em três grupos, que receberam solução de Luffa operculata em concentração terapêutica 30 dias. Depois de receberem o fármaco, amostras de sangue, fígado, rim, cérebro e pulmão foram colhidas dos animais para avaliação histopatológica.

Os valores de avaliação histológica da mucosa também foram descritos de acordo com os grupos e tempos com o uso de frequências absolutas e relativas. Eles foram comparados com o teste não paramétrico de Wilcoxon para a infiltração de células inflamatórias, variáveis de proliferação conjuntiva, vascular e fibrosa. As comparações foram feitas para investigar as diferenças entre os grupos ou os tempos de acompanhamento. Todos os testes foram feitos com nível de significância de 10%.

As secreções sinusais foram colhidas do interior de cada seio maxilar de coelho com cotonete (Culturette®) após a eutanásia. As secreções recolhidas foram semeadas em agar‐sangue e agar‐chocolate. As bactérias encontradas após o procedimento estão descritas na tabela 1.

A avaliação histológica da mucosa sinusal mostrou vários graus de inflamação, caracterizados pela intensa infiltração de células inflamatórias (fig. 2), alterações epiteliais (fig. 3), neovascularização, destruição glandular e proliferação conjuntivo‐fibrosa à mucosa praticamente normal (fig. 4). As variações estavam presentes em ambos os grupos de tratamento (tabela 2).

Figura 2.

Mucosa do seio maxilar mostra intenso infiltrado linfocítico (seta estreita) e destruição glandular (seta larga) – microscopia óptica, coloração HE, 200×.

(0,26MB).

Figura 3.

Mucosa do seio maxilar mostra áreas de erosão no epitélio (setas) e células inflamatórias. Microscopia óptica, coloração HE, 100×.

(0,21MB).

Figura 4.

Mucosa do seio maxilar mostra epitélio normal, sem processo inflamatório. Microscopia óptica, coloração HE, 100×.

(0,1MB).

Esses dados mostram uma diferença estatisticamente significante entre os grupos e os tempos de tratamento na avaliação global dos três diferentes critérios usados para a análise histológica.

As análises histológicas não demonstraram toxicidade nos órgãos estudados que pudesse estar relacionada ao uso de Luffa operculata.

A avaliação fitoquímica de Luffa operculata foi feita através de cromatografia líquida com coluna de fase reversa. A eluição foi feita no modo gradiente a uma taxa de fluxo de 1,0mL/min e detecção de UV a 254nm. A substância principal foi escolhida como marcador fitoquímico. A análise quantitativa foi feita com o método do padrão externo e o marcador, devidamente purificado e identificado, foi usado como padrão.

O extrato aquoso bruto foi fraccionado por extração em fase sólida com fase reversa (EFS‐C18), com gel de sílica C18 como adsorvente. Foram obtidas dez fracções, que depois foram eluídas com água inicialmente e subsequentemente foram feitas misturas de água/MeOH para 100% de MeOH. A purificação final do composto foi feita por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

Os espectros de NMR foram obtidos no espectrômetro 500 (11,7T), a 500MHz e 125MHz para 13C, com amostras dissolvidas em D2O. Os espectros de massa de alta resolução foram obtidos e os espectros foram obtidos nos modos positivo e negativo.

A substância purificada, obtida na forma de um composto sólido esbranquiçado, foi identificada como ácido 2,3‐dicafeoilglicarico. Esse composto não foi previamente descrito na literatura.

O espectro de massa de alta resolução no modo positivo apresentou cátions a m/z 543.1177 [M+Na]+(calculado 543.1109) e o modo negativo mostrou o íon a m/z 519.1221 [MH] ‐ (calculado 519.1144), o que indicou a fórmula molecular C24H24O13. Além disso, pode‐se observar a perda de duas unidades cafeoil (162) para MS2, tanto no modo positivo como no modo negativo. Determinou‐se que a pureza cromatográfica desse padrão era igual a 86,97%.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 – sensível à meticilina (MSSA) e Staphylococcus aureus ATCC 43300 – resistente à meticilina (MRSA) foram usados como agentes bacterianos e cultivados em placas Muller‐Hilton. Após 24 horas de incubação foi observado crescimento bacteriano em todas as amostras. As placas foram cultivadas com e sem a presença de Luffa operculata em extrato aquoso 1% e 0,5% e ácido 2,3‐dicafeoilglicarico 1%. Quanto maior a concentração do fármaco, maior era a inibição do crescimento bacteriano nas amostras. Quando isolado, o princípio ativo mostrou‐se mais eficaz do que as amostras com extrato de Luffa operculata nas mesmas concentrações. O princípio ativo a 1% foi mais eficaz do que o extrato aquoso a 1%, que por sua vez foi mais eficiente do que o extrato aquoso a 0,5%. Todas as placas com Streptococcus pyogenes ATCC 19615 tiveram seu crescimento bacteriano comprometido pela ação de Luffa operculata em diferentes concentrações e nenhuma diferença foi observada para Staphylococcus aureus ATCC 25923 – Sensível à Meticilina (MSSA) e Staphylococcus aureus ATCC 43300 – Resistente à Meticilina (MRSA).