As linhagens de células humanas de CNF (CNE‐1, CNE‐2, HNE‐1, HONE‐1 e SUNE‐1) e a linhagem de células humanas imortalizadas do epitélio nasofaríngeo NP69 foram preservadas pelo nosso laboratório. A CNE1 é uma linhagem de carcinoma de células escamosas bem diferenciada de carcinoma nasofaríngeo; CNE2, HNE1, HONE1, SUNE1 são linhagens de células escamosas pouco diferenciadas de carcinoma nasofaríngeo; a NP69 é uma linhagem de células epitelial nasofaríngeas imortalizadas, apresenta crescimento epitelioide e aderente escamoso, com características normais do epitélio nasofaríngeo. As cinco linhas de células CNF foram cultivadas em meio RPMI‐1640 (Gibco, Life Technologies Inc., Carlsbad, CA, EUA), contêm 10% de soro fetal bovino (FBS, Tianhang Biotechnology Co., Ltd., Zhejiang, China). As células NP69 foram cultivadas em meio queratinócito/isento de soro (K‐SFM; Gibco) suplementado com extrato de pituitária bovina (BPE; Gibco) e fator de crescimento epidérmico (EGF, recombinante humano; Gibco).

Todas as células foram cultivadas a 37 com 5% de CO2. Os plasmídeos SGK3 shRNA foram todos produzidos por GeneCopoeia Inc., Rockville, MD, EUA e incluíram sh1025, sh1132, sh1206 e sh1284; as sequências são 5’‐GCTAGTGCATTGGGTTACTTA‐3’, 5’‐GCTTTGTAAAGAAGGAATTGC‐3’, 5’‐GCCGAGATGTTGCTGAAATGT‐3’, e 5’‐GGTCCATTCTGGAAGAACTCC‐3’, respectivamente. O plasmídeo de controle negativo (CN), sequência 5’‐GCTTCGCGCCGTAGTCTTA‐3’, também foi adquirido da GeneCopoeia Inc. Para se obter a melhor sequência do plasmídeo no silenciamento do gene, as células foram semeadas antes de ser transfectadas e seu crescimento foi permitido até a densidade de 60% no segundo dia. O polímero catiônico PEI (adquirido da Aladdin Inc.) foi usado para transfectar os plasmídeos com diferentes sequências de ShRNA (local silencioso diferente de SGK3) nas células. Após 72 horas, as proteínas das células foram extraídas e Western blot foi usado para observar os efeitos de silenciamento de ShRNA em SGK3 e selecionar o plasmídeo com a melhor sequência de silenciamento. A melhor sequência é 5’‐GCTAGTGCATTGGGTTACTTA‐3’.

A incubadora de dióxido de carbono foi produzida pela Thermo Fisher Scientific Inc., EUA. Micrótomo rotativo HM340E‐ e equipamento de coloração de hematoxilina‐eosina (HE) totalmente automático foram produzidos pela MICROM Inc., Alemanha. O aparelho de eletroforese vertical e o sistema transmembrana foram produzidos pela Bio‐Rad Inc., Hercules, Califórnia, EUA. O sistema de imagem por quimiluminescência ChemiDocTM XRS + também foi produzido pela Bio‐Rad Inc. O citômetro de fluxo BD FACSCaliburTM foi produzido pela BD Biosciences Inc. California, EUA. O microscópio de fluorescência invertida foi produzido por Carl Zeiss Co. Ltd., Alemanha.

Quarenta e duas amostras de tecido embebidas em parafina de CNF e nove amostras de tecido de nasofaringite crônica foram obtidas do Departamento de Otorrinolaringologia do Zhujiang Hospital. Os dados clinicopatológicos são apresentados nas tabelas 1 e 2. A expressão de SGK3 nas amostras foi analisada através de imuno‐histoquímica com o kit de detecção de duas fases Elivision (Kit‐0015; Fuzhou Maixin Biotech. Co., Ltd., China). Essas amostras foram desparafinizadas e pré‐tratadas ao ferver as lâminas em solução tampão citrato (pH 6.0) por 10min. As amostras foram então imersas em peróxido de hidrogênio a 3% por 10min à temperatura ambiente para bloquear a atividade da peroxidase endógena tecidual. Após a lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS), as amostras foram incubadas com anticorpo policlonal de coelho SGK3 (catálogo n° ab153981; 1: 200; Abcam Company, EUA) a 4°C durante a noite e então as amostras foram incubadas com 50μL de polímero amplificador (reagente A) e 50μL de IgG anticamundongo/coelho conjugado com peroxidade de horseradish (reagente B) durante 30min à temperatura ambiente. Após a lavagem com PBS, as amostras foram coradas com solução cromogênica de diaminobenzidina (DAB) e contrastadas com hematoxilina, diferenciadas com ácido clorídrico em etanol, coradas em azul pela lavagem com água e seladas com resina convencional.17 Os resultados foram avaliados pelo método HSCORE, que incluiu tanto a intensidade quanto o escore de distribuição da coloração específica, avaliados por dois patologistas de forma independente.18 Os escores de distribuição da expressão de SGK3 foram registrados como porcentagens de células coradas positivamente em cada uma das quatro categorias de intensidade, que foram classificadas como 0 (sem coloração), 1 (coloração fraca), 2 (coloração acentuada) e 3 (coloração forte). O HSCORE de cada tecido foi derivado pela soma dos quatro escores de distribuição (D) de cada categoria multiplicados pelos escores de intensidade (i) como mostrado a seguir: HSCORE = ∑D (i), onde D variou de 0% a 100% e i = 0, 1, 2, ou 3. O HSCORE máximo foi 300 e o mínimo foi 0. Um HSCORE = 75 foi usado como o ponto de corte para distinguir entre a expressão positiva e a negativa.

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética (n° 2016‐EBYHK‐002).

As proteínas totais foram extraídas de células com tampão de lise RIPA (Kaiji Biotechnology Co., Ltd., Jiangsu, China). As concentrações de proteína foram determinadas com ensaios de proteína (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Xangai, China). As proteínas purificadas (50μL) foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS‐PAGE) e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas durante 2 horas à temperatura ambiente em leite desnatado a 5% e incubadas durante a noite a 4°C com anticorpo anti‐SGK3 (Abcam Company, 1:1000). Após a incubação com Horseradish Peroxidase (HRP), anticorpo secundário ligado (Biosharp Biotechnology Co., Ltd., Hefei, China) (1:5000), as membranas foram lavadas e as proteínas foram visualizadas com ‐se um kit de quimiluminescência melhorado (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EUA). Os resultados do Western blot foram analisados semiquantitativamente com o software Image Pro Plus.19

As células CNE‐2 de fase logarítmica foram semeadas em placas de seis poços durante 24 horas antes da transfecção atingir 80%‐90% de confluência. As células em cada poço foram transfectadas com 4μg de shRNA SGK3 ou plasmídeo CN e 10μL de Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Life Technologies Inc., Carlsbad, Califórnia, EUA). Células não tratadas foram usadas como controle. Todas as células foram cultivadas a 37°C por 24 horas. Após determinar o sucesso da transfecção de acordo com o grau de proteína fluorescente verde (GFP, do inglês Green Fluorescent Protein) por microscopia de fluorescência, as células foram cultivadas por mais 48 horas e colhidas para análise de Western blot para identificar o plasmídeo com o maior efeito sobre o knockdown de SGK3.20 As células tratadas foram colhidas para experimentos subsequentes. As células transfectadas com sucesso com o plasmídeo shRNA do SGK3 ou CN foram chamadas de grupo shSGK3 ou CN, respectivamente. As células CNE‐2 serviram como controle branco (grupo controle). Todos os experimentos in vitro foram feitos para cada grupo.

As células CNE‐2 nos três grupos foram cultivadas em placas de 96 poços (5.000 células/poço em 5 poços). O crescimento celular foi avaliado com um ensaio de MTT (brometo de [3‐(4,5‐dimetiltiazol‐2‐il)‐2,5‐difeniltetrazólio) com uma placa conduzida nos pontos temporais indicados durante três dias consecutivos. Cada poço continha 20μL de reagente MTT e foi então cultivado a 37°C por 4 horas. O meio foi descartado e os cristais que se formaram foram dissolvidos em 150μL de dimetil‐sulfóxido (DMSO). As células viáveis em cada poço foram determinadas a cada dia através da medida de um comprimento de onda de absorbância de 490nm. Cada experimento foi repetido de forma independente por três vezes. As curvas de crescimento celular foram subsequentemente geradas.20

As células CNE‐2 nos três grupos foram semeadas em placas de seis poços (50.000 células/poço) e cultivadas por 48 horas. No fim da incubação, todas as células foram tripsinizadas, lavadas duas vezes com solução salina pré‐resfriada tamponada com fosfato (PBS, HyClone, Logan, UT, EUA), coletadas e ressuspensas em 100μL de tampão de ligação. Em seguida, 5μL de anexina V‐APC e 5μL de PI foram adicionados e as placas foram incubadas por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. As células foram imediatamente examinadas por citometria de fluxo. Os dados foram analisados pelo software ModFit LT 2.0.21

As células CNE‐2 foram adicionadas a placas de seis poços (50.000 células/poço). Uma vez que as células cresceram até aproximadamente 100% de confluência, os testes de foram feitos com uma ponta de pipeta estéril de 200μL para raspar a monocamada confluente. A área raspada foi lavada com PBS até as células separadas serem removidas. Adicionou‐se meio isento de soro e as células foram cultivadas a 37°C. A distância entre as células na área raspada em 0, 24 e 48 horas foi medida por microscopia.22 A migração celular horizontal foi analisada através do software Image J e calculada com a seguinte fórmula: mobilidade relativa = 1 (largura imediata da raspagem/ largura da raspagem original).

A avaliação estatística foi feita no programa SPSS 22.0 ou Graph Pad Prism 6. Todos os dados foram adquiridos de pelo menos três experimentos independentes e os resultados são apresentados como média ± desvio padrão. Análise de variância (Anova) de um fator e testes t de Student foram usados para comparar as diferenças de médias entre os grupos.

A associação da expressão de SGK3 com as características clínicas em CNF foi avaliada por análise de regressão logística. Um valor de p < 0,05 indicou uma diferença significante.

A figura 1A mostra a expressão da proteína SGK3 nos tecidos. As taxas de expressão positiva de SGK3 nos tecidos de CNF e nos tecidos de nasofaringite crônica foram 90,50% (38/42) e 11,10% (1/9), respectivamente. A taxa de expressão de SGK3 em diferentes fases de CNF e nos tecidos de nasofaringite crônica foi avaliada de acordo com o HSCORE.

Figura 1.

Coloração imuno‐histoquímica representativa da SGK3 em tecidos de CNF. (A) Os resultados imuno‐histoquímicos mostraram que a expressão da proteína SGK3 estava localizada principalmente no citoplasma, com expressão fortemente positiva de SGK3 em tecidos de câncer de CNF e sem expressão ou expressão fraca em tecidos de nasofaringite crônica. (B) Taxa de expressão da SGK3 em diferentes estágios de CNF e tecidos de nasofaringite crônica de acordo com o HSCORE. A expressão da SGK3 nos tecidos de CNF de estágio I, II, III e IV foi significativamente maior do que nos tecidos de nasofaringite crônica (p < 0,01). No entanto, não houve diferença significativa entre os diferentes estágios do CNF (p > 0,05).

(0,73MB).

O nível de expressão da SGK3 foi significantemente maior em CNF do que na nasofaringite crônica (p < 0,01) (fig. 1B), indicou que a expressão da SGK3 está relacionada à carcinogênese do CNF. Entretanto, a expressão de SGK3 não foi correlacionada com sexo, idade, estágio TNM ou estágio clínico (p > 0,05) (tabela 3).

A expressão da proteína SGK3 em diferentes linhagens celulares de CNF e células NP69 é mostrada na figura 2. A SGK3 foi mais altamente expressa na maioria das células de CNF (CNE‐2, HNE‐1, SUNE‐1) do que em células NP69 (p < 0,01). Além disso, as células CNE‐2 e HNE‐1 exibiram níveis mais altos de expressão de SGK3 do que outras linhagens de células de CNF (p < 0,01). Os resultados da análise de Western blot foram consistentes com os da análise imuno‐histoquímica. Esses resultados também indicaram que o SGK3 pode estar intimamente relacionado ao desenvolvimento de CNF.

Figura 2.

Detecção da expressão da proteína SGK3 em linhagens de células de CNF. (A) Expressão representativa da proteína SGK3 em diferentes linhagens celulares de CNF e células NP69 detectadas por análise de Western blot. (B) Análise do valor de cinza da expressão da proteína SGK3 como a proporção entre a SGK3 e a p‐actina nos resultados de Western blot; a SGK3 foi mais altamente expressa na maioria das linhagens de células de CNF (CNE‐2, HNE‐1, SUNE‐1) do que nas células NP69 (p < 0,01).

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Os plasmídeos SGK3 shRNA e NC foram transfectados com sucesso para as células CNE‐2 (fig. 3A). Os resultados de triagem do plasmídeo shRNA mais eficaz que teve como alvo a SGK3 (shSGK3) são apresentados na figura 3B, que mostra que a proteína SGK3 foi notavelmente reduzida no grupo sh1025 em comparação com os outros grupos de plasmídeo e controle (p < 0,01) (fig. 3B e C). O plasmídeo sh1025 teve o efeito mais significativo no knockdown de SGK3; portanto, as células do grupo sh1025 foram chamadas de grupo hSGK3 e usadas em experiências subsequentes. Os resultados do Western blot mostraram que o nível da proteína SGK3 foi acentuadamente reduzido no grupo shSGK3 em comparação com o grupo CN e controle (p < 0,01) (fig. 3D e E) e nenhuma diferença significativa na expressão de SGK3 foi observada entre o grupo CN e o grupo de controle.

Figura 3.

Melhor rastreamento de shRNA da SGK3 e eficiência do silenciamento da SGK3 pelo shRNA específico em células CNE‐2. (A) Expressão verde fluorescente da proteína em células CNE‐2 observada por microscopia de fluorescência após transfecção com o shRNA da SGK3 ou plasmídeo NC. (B) Expressão representativa da proteína SGK3 em células CNE‐2 tratadas com diferentes plasmídeos de shRNA da SGK3 determinadas por análise de Western blot. (C) Análise do valor de cinza de expressão da proteína SGK3 como a proporção entre a SGK3 e a p‐actina em resultados de Western blot. O plasmídeo sh1025 mostrou o efeito mais significativo no knockdown da SGK3 (p < 0,01). (D) Expressão representativa da proteína SGK3 nos grupos shSGK3, NC e controle determinados por análise de Western blot. (E) Análise do valor cinza da expressão da proteína SGK3 como a proporção entre a SGK3 e a β‐actina nos resultados de Western blot; a expressão da SGK3 no grupo shSGK3 foi obviamente reduzida em comparação com a dos grupos NC e controle (*#p < 0,01).

(0,53MB).

Para confirmar o efeito de inibição celular de shRNA SGK3, seus efeitos citotóxicos foram avaliados. A figura 4A mostra uma falha de toxicidade no grupo CN e óbvia citotoxicidade no grupo shSGK3 às 24, 48 e 72 horas (p < 0,01).

Figura 4.

Efeito da down‐regulação da SGK3 na capacidade proliferativa e apoptose de células CNE‐2. Ensaio MTT (A) e análise de apoptose (B e C) por citometria de fluxo nos diferentes grupos. A taxa de viabilidade celular no grupo shSGK3 estava obviamente reduzida em comparação com a dos grupos NC e controle e a taxa de apoptose celular no grupo shSGK3 estava obviamente aumentada em comparação com a dos grupos NC e controle. (*#p < 0,01).

(0,48MB).

Para determinar se shRNA SGK3 poderia efetivamente induzir a apoptose celular, determinamos a porcentagem de apoptose celular após as células CNE‐2 terem sido transfectadas com shRNA SGK3. Como mostrado na figura 4B, as células CNE‐2 exibiram apoptose limitada no grupo CN em comparação com o grupo controle, o que foi consistente com os resultados da análise de citotoxicidade. As porcentagens de apoptose celular (inclusive apoptose precoce e tardia) no grupo shSGK3, no grupo NC e no grupo controle após 48 horas foram de 17,85%, 7,49% e 6,70%, respectivamente. As células tratadas com shRNA SGK3 exibiram um aumento mais óbvio na apoptose (p < 0,01) (fig. 4C).

Para detectar a capacidade de invasão e metástase das células tumorais, o teste de raspagem celular foi feito no grupo controle, no grupo CN e no grupo shSGK3. Como mostrado na figura 5A, a taxa de migração horizontal de células no grupo shSGK3 após 24 horas foi de 20,50%, enquanto essas taxas foram de 51,60% e 56,60% no grupo CN e controle, respectivamente. Após 48 horas, as células do grupo shSGK3 ainda não haviam se recuperado do dano. A taxa de migração celular horizontal foi de 46,70%, mas os arranhões no grupo CN e no grupo controle eram pouco visíveis. Esses resultados sugerem que a capacidade migratória das células tratadas com shSGK3 foi obviamente diminuída em comparação com a do grupo CN e do grupo controle (p < 0,01) (fig. 5B).

Figura 5.

O efeito da down‐regulação da SGK3 na motilidade das células CNE‐2. (A) Distância em diferentes momentos após o teste da raspagem (ampliação original: X 5). As distâncias das raspagens no grupo shSGK3 não mudaram de maneira óbvia após 24 horas, enquanto as células nos grupos NC e controle exibiram taxas de migração mais altas (p < 0,01). Após 48 horas, as células do grupo shSGK3 ainda não haviam se recuperado do dano (p < 0,01), mas as raspagens celulares dos grupos NC e controle dificilmente eram visíveis. (B) Comparação das taxas de migração celular em diferentes momentos pelo teste de arranhadura; as taxas de migração celular no grupo shSGK3 foram maiores do que as dos grupos NC e controle após 24 e 48 horas (△◊p < 0,01).

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