Conforme descrito por Morsli et al. (1998),13 o desenvolvimento coclear começa a partir da invaginação de um espessamento ectodérmico no placódio ótico, formando uma vesícula ótica. As células multipotentes presentes na vesícula ótica então se diferenciam em três linhagens celulares: (i) linhagem pró‐sensorial, que dá origem às células ciliadas e de suporte; (ii) linhagem pró‐neural, que dá origem aos neurônios auditivos e vestibulares; e (iii) linhagem não sensorial, responsável pela origem das células com funções estruturais, secretoras e/ou de absorção.14

A diferenciação in vitro em células neuronais ciliadas ou sensoriais a partir de CTs embrionárias humanas foi relacionada à expressão de vários marcadores bem caracterizados para cada uma das etapas. Entretanto, a obtenção de células neuronais auditivas e ciliadas apresenta um grande desafio, tanto na escolha do meio de cultura quanto nos fatores específicos necessários para direcionar a diferenciação das células progenitoras óticas para um tipo celular desejado.

De acordo com alguns estudos, o meio de cultura sem soro e com suplementos N2 e B27 é o ponto de partida para a diferenciação de CTEs em progenitores neurais (PNs), expressando marcadores característicos de neuroblastos de placódio ótico, tais como Otx2, Brn3a, NeuroD, Pax2, Pax8 e nestina.15–17 Entretanto, a eficiência desses suplementos e substratos de cultura celular no processo de diferenciação varia, mesmo quando o objetivo é gerar os mesmos tipos de células. Shi et al. (2007)16 fizeram a cocultura das CTEs humanas a partir de epitélio sensorial da cóclea de camundongos na presença do fator BMP4. Essa cocultura foi determinante para a expressão de periferina, GATA3, TRKB, TRKC e NGN1, marcadores de neurônios auditivos, em até 20,6% das células. Por outro lado, células imaturas semelhantes a células ciliadas também podem ser obtidas por meio da ativação da via de sinalização de FGF e cultivo por tempo prolongado com meio de cultura KSR (Knockout Serum Replacement), embora com baixa eficiência de diferenciação.17 Nesse caso, apenas cerca de 3% das células ciliadas expressaram três ou mais marcadores específicos ao seu fenótipo, como ATOH1, MYO7A, MYO15A e OTOF. Também já foi observado que CTEs humanas dissociadas em uma camada de laminina e tratadas com FGF3 e FGF10 foram capazes de gerar dois tipos de colônias de células progenitoras óticas: progenitores epiteliais óticos (PEOs) e progenitores neurais óticos (PNOs). Ao submeter os PEOs a condições de cultivo específico para obtenção de células sensoriais, produziram‐se células semelhantes que expressavam os marcadores relacionados ao fenótipo das células ciliadas (BRNC3 e ATOH1 ou MYO7A), com 45% de eficiência; além disso, ao submeter PNOs a condições de cultura “neutralizante”, produziram‐se neurônios sensoriais com quase 100% de eficiência e com expressão de BRN3A, β‐tubulina III e NF200. Também foi demonstrado que essas células semelhantes a células ciliadas e aos neurônios sensoriais exibem propriedades eletrofisiológicas, demonstrando a viabilidade dessas células em responder a estímulos mecânicos e transmitir estímulos elétricos.15

Para obter neurônios sensoriais gerados a partir de CTEs, alguns autores se concentraram em provar que tais células são capazes de projetar processos neurais em direção à cóclea, seja in vitro ou in vivo. Shi et al. (2007),16 por exemplo, mostraram que os progenitores neurais sensoriais diferenciados a partir de CTE humanas foram capazes de amadurecer, de se transformar em neurônios sensoriais e inervar células ciliadas de explantes de órgão de Corti murino, ainda que escassamente. Além disso, foi detectada a expressão de β‐tubulina e sinapsina nos locais de contato. Resultados semelhantes também foram observados por Nayagam et al. (2013),18 que cocultivaram progenitores neurais humanos com explantes de cóclea murinos denervados por 10 dias.

Em ensaios in vivo, Shi et al. (2007)16 transplantaram progenitores neurais, previamente diferenciados de CTE humanas, na base da cóclea de gerbils com ablação do VIII nervo craniano. Após 60 dias do procedimento, as cócleas tratadas apresentaram abundantes projeções neurais novas em direção ao ápice do tronco do nervo coclear. De maneira similar, Chen et al. (2012)15 transplantaram PNOs para o modíolo de gerbils com ablação do VIII nervo craniano e, três semanas após o transplante, observaram PNOs que expressavam β‐tubulina III e que emitiam projeções neurais em direção ao órgão de Corti. Dez semanas após o transplante, essas células também migraram para o canal de Rosenthal, fizeram conexões sinápticas com as células ciliadas e emitiram novas projeções em direção ao tronco cerebral. No entanto, o resultado mais importante deste estudo é que os animais transplantados com PNOs foram submetidos a testes de desempenho funcional e apresentaram melhoria auditiva de aproximadamente 46%, com redução dos limiares auditivos dos animais tratados com ouabaína de aproximadamente 80dB para 50dB, dez semanas após o transplante.

Para nosso conhecimento, a primeira evidência da existência de CT na orelha interna (CTOI) de mamíferos data de 2003. Li et al. (2003) 19 demonstraram a existência de células do labirinto posterior ou vestíbulo (sistema vestibular periférico) com capacidade de formar esferas, com propriedades de autorrenovação e diferenciação em células dos três folhetos germinativos. Os pesquisadores demonstraram que essas CTAs, obtidas especificamente da mácula utricular, poderiam se diferenciar em células ciliadas, tanto in vitro quanto in vivo.

Até o momento, não há relatos da existência de CTOI na cóclea de mamíferos adultos. Entretanto, a existência de células com propriedades de CT foi evidenciada a partir de suspensões de células dissociadas do órgão de Corti de ratos neonatos (P0). 20 Após o cultivo, essas células expressaram marcadores de células indiferenciadas, relacionados a um fenótipo similar ao encontrado em CTOI neuroepiteliais. Além disso, essas células mostraram a formação de colônias esféricas, denominadas otosferas, e foram diferenciadas in vitro em células ciliadas e de suporte, embora com uma taxa de eficiência extremamente baixa (cerca de 1‐2 células por colônia).

Em um estudo mais detalhado realizados a partir de suspensões de células dissociadas do órgão de Corti de fetos humanos com nove a 11 semanas de desenvolvimento,21 CTOI com expressão de marcadores de pluripotência também foram identificados. Após o estabelecimento da cultura, vários experimentos de manipulação de cultura foram feitos para induzir a diferenciação em células neuronais e ciliadas. Os melhores protocolos devem, idealmente, resultar em células diferenciadas que exibem não apenas marcadores celulares desses tipos específicos, mas também propriedades eletrofisiológicas semelhantes a esses tipos de células in vivo. Isso foi obtido por meio de tripsinização, com adição de Shh e bFGF para diferenciação neuronal, com eficiência de 49%, e por meio de suplementação de meio de cultura com EGF e ácido retinoico para diferenciação de células ciliadas, com eficiência de 56%.

Como mencionado anteriormente, a capacidade regenerativa da cóclea dos mamíferos é inexistente. No entanto, se há evidências da existência de CTOI na cóclea de ratos neonatos e fetos humanos, bem como no vestíbulo de camundongos adultos, qual é a razão por trás da incapacidade regenerativa da cóclea de mamíferos? Para responder a essa pergunta, Oshima et al. (2007)22 investigaram a distribuição de CTOI na orelha interna de camundongos com idades que variaram de P1 a P120. As CTOI foram obtidas tanto do sistema vestibular, representado pela mácula utricular, mácula sacular e crista ampular, como do sistema coclear, representado pelo órgão de Corti, gânglio espiral e estria vascular em camundongos com idade até P21, com um rápido declínio na população dessas células no órgão de Corti na 2ª e 3ª semanas de vida. Ao investigar camundongos P120, CTOI foram ainda identificadas nas três regiões vestibulares estudadas, mas, aparentemente, estão ausentes no órgão de Corti por volta dessa idade. Duas hipóteses foram levantadas para o esgotamento dessa população de células pluripotentes: (i) perda de fato de CTOI durante as primeiras duas semanas de desenvolvimento pós‐natal, 23 devido à apoptose na grande crista epitelial (GCE), um epitélio adjacente ao órgão de Corti e que contém células com capacidade proliferativa; 24 ou (ii) perda da expressão de marcadores de pluripotência por por parte dessas células durante a maturação da cóclea, como resultado do processo de diferenciação. 25 Nesse último caso, as otosferas formadas a partir do órgão de Corti teriam se originado a partir de células de suporte pós‐mitóticas, uma vez que a capacidade dessas células de proliferar e se diferenciar in vitro em células ciliadas já foi demonstrada. Até o momento, nenhuma das hipóteses foi refutada.

Em suma, embora a orelha interna tenha células‐tronco após o desenvolvimento do sistema auditivo, tanto no vestíbulo quanto na cóclea, essa população de células é limitada apenas à região vestibular na idade adulta. Soma‐se a essa limitação a grande dificuldade de obtenção dessas células e a baixa eficiência de sua diferenciação nos tipos celulares desejados. Portanto, as CTOI são atualmente mais úteis como objeto de estudo de diferenciação básica e triagem de ototoxicidade, em vez de uma opção para terapia celular relacionada a distúrbios auditivos.

Conforme revisado por Keating (2012),26 as CTMs são definidas como um fenômeno resultante da cultura in vitro e foram inicialmente identificadas como uma subpopulação de células da medula óssea. Os critérios para definir CTMs incluem a aderência ao plástico, diferenciação in vitro em células adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas, expressão dos marcadores CD105, CD73 e CD90 e a ausência de expressão dos marcadores hematopoiéticos.27,28 A capacidade de diferenciação de múltiplas linhagens de CTs mesenquimais as torna muito valiosas para terapias médicas baseadas em células. Entre as muitas propriedades úteis das CTMs estão as propriedades imunomoduladoras, que as tornaram atraentes para a medicina regenerativa.29

As progenitoras de células ciliadas diferenciadas de CTs mesenquimais foram obtidas primeiro por Jeon et al. (2007).30 As CTMs obtidas da medula óssea de camundongos foram inicialmente transfectadas com o fator de transcrição EGFP‐Math1 e depois diferenciadas em precursores sensoriais através de cultura com EGF, IGF‐1, bFGF, NT3 e BDNF por 14 dias. No 14° dia, os autores observaram que a superexpressão de Math1 foi capaz de induzir a expressão de marcadores específicos de células epiteliais sensoriais auditivas, tais como BRN3C, P27KIP e JAGGED2. A expressão de marcadores de células ciliadas maduras, tais como MYO7a e ESPIN, também foi detectada em 7,1% das células transfectadas, indicando a diferenciação das CTMs murinas em células ciliadas.

As células ciliadas também foram obtidas, em cultura, a partir de CTMs de medula óssea de ratos. No relato de Qin et al. (2011),31 as CTMs da medula óssea foram primeiramente diferenciadas em progenitores neurais através de cultura em meio sem soro e contendo EGF e bFGF. Após duas semanas de cultivo em meio contendo N2/B27, EGF e IGF‐1, a expressão de MYO7a foi detectada através de ensaios imuno‐histoquímicos, sugerindo que essas células são fenotipicamente semelhantes às células ciliadas. Outros fatores de transcrição adicionados ao meio de cultura das CTMs da medula óssea também contribuíram para a produção de células progenitoras neurais, neurônios e células ciliadas. Lee et al. (2012),32 por exemplo, usaram os fatores BDNF, GDNF e NT3 em meio de cultura por 14 dias. Novas células ciliadas foram obtidas, como pôde ser confirmado por RT‐qPCR e ensaios imuno‐histoquímicos, mostrando que de 3% a 4% das células expressaram MYO7a.

Com o objetivo de induzir a diferenciação em células ciliadas a partir de CTMs de medula óssea humana, Alonso et al. (2012)33 identificaram alguns pré‐requisitos espécie‐específicos para o processo ser bem‐sucedido. Inicialmente, eles obtiveram células progenitoras neurais com quatro protocolos bem estabelecidos, expressando vários marcadores de progenitores neurais, como nestina, SOX‐2, OCT‐4 e musashi‐1. Contudo, embora combinações de EGF, bFGF e IGF‐1 já fossem reconhecidas como importantes para a indução do fenótipo de células ciliadas a partir de CTMs de medula óssea de ratos, os autores não obtiveram os mesmos resultados para a contraparte humana. Nesse caso, a indução do fenótipo de células ciliadas só foi possível após a cultura das células humanas em meio sem soro e com EGF e ácido retinoico, protocolo esse usado anteriormente para a diferenciação de CTOI humanas em células ciliadas.21 As células humanas diferenciadas expressaram marcadores específicos de células ciliadas, tais como ATOH1, MYO7a e calretinina, com eficiência máxima de 17,5%.33

Células ciliadas também podem ser diferenciadas a partir de CTMs obtidas de outros tecidos que não a medula óssea, como o tecido adiposo. Lin et al. (2012),34 por exemplo, reprogramaram CTMs derivadas de tecido adiposo murino em progenitores de células ciliadas com uma combinação de transfecção de proteína, adenovírus e cocultura com neurônios. As CTMs foram transfectadas com adenovírus que expressam ATOH, um fator de transcrição fundamental para o desenvolvimento de células ciliadas, fundido com EGFP (proteína verde fluorescente melhorada). Após dois dias, todas as células marcadas com EGFP expressaram o marcador de células ciliadas MYO7a. Aproximadamente 82% das células submetidas à expressão de Atoh1 apresentaram protrusões na superfície celular, semelhantes aos estereocílios. É importante ressaltar que o grupo de Lin foi o primeiro a obter células ciliadas diretamente de CTs multipotentes sem diferenciação prévia em células progenitoras ópticas, mostrando, portanto, que o processo de diferenciação em células ciliadas pode ser acelerado.

Em relação à obtenção de neurônios auditivos a partir de CTMs, Alonso et al. (2012)33 primeiro diferenciaram CTMs de medula óssea humana em progenitores neurais e, em seguida, induziram fenótipo de neurônios sensoriais por meio de suplementação do meio de cultura com SHH, ácido retinoico, BDNF, NT‐3 e bFGF. No fim do protocolo de diferenciação, os autores observaram a expressão dos marcadores de neurônios sensoriais GATA‐3, SOX2, NGN‐1 e ISLET‐1 em até 47% das células. No estudo de Lee et al. (2012),32 o processo de diferenciação consistiu na incubação de CTMs de medula óssea de rato durante cinco dias em meio de cultura suplementado com DMEM/F12, N2, B27, EGF e IGF‐1, para indução do fenótipo de progenitor neural. Os progenitores neurais foram então diferenciados em neurônios auditivos ao se substituir o meio de cultura por um meio de fator neurotrófico básico com GDNF, BDNF e NT‐3. No fim do experimento, os ensaios de RT‐qPCR e imunofluorescência confirmaram a expressão dos marcadores neuronais NeuN e β‐tubulina III em 7% a 8% das células diferenciadas.

Com o objetivo de desenvolver um modelo celular para o estudo da patogênese do vírus varicela zoster (VVZ), Lee et al. (2012)35 se concentraram na geração de neurônios sensoriais in vitro a partir de CTPis, uma vez que o VVZ se mantém latente nos gânglios sensoriais. Para esse propósito, células CTPi diferenciadas a partir de fibroblastos foram expostas a pequenas moléculas inibitórias e ácido retinoico por 10 dias, convertendo as células pluripotentes em progenitoras neurais, que expressavam os marcadores de progenitores neurais PAX6 e nestina. Após o cultivo por duas semanas em meio de cultura rico em fatores de crescimento, 80% das células expressaram β‐tubulina III, um marcador neuronal, enquanto 15% coexpressaram BRN3A e periferina, marcadores neuronais sensoriais. Os neurônios sensoriais diferenciados a partir de CTPi também sendo funcionais, sendo capazes de gerar potenciais de ação em resposta à despolarização.

Gunewardene et al. (2014)36 também foram bem‐sucedidos no estabelecimento in vitro de linhagens celulares sensorioneurais a partir de duas linhagens de CTPis humanas derivadas do prepúcio. As células foram submetidas ao seguinte processo de diferenciação: (i) indução neuronal, com o uso de Noggin e de bFGF; (ii) indução de neurosfera, com EGF e bFGF; (iii) indução de crista neural, tratada com inibidor de Rho quinase; e, finalmente, (iv) a indução de neurônios sensoriais por meio do cultivo somente com NBM. As células sensorioneurais derivadas das CTPis humana expressaram marcadores de rombencéfalo dorsal (PAX7), placódio ótico (PAX2), domínio pró‐neuro‐sensorial (SOX2), gânglios neurais (neurod1, BRN3A, ISLET1, β‐tubulina III, NFM) e neurônios sensoriais (GATA3 e VGLUT1) ao longo do período examinado, com os maiores níveis de expressão observados no 35° dia de diferenciação in vitro. Os neurônios sensoriais diferenciados também eram eletrofisiologicamente ativos, embora o padrão de atividade observado fosse mais semelhante aos neurônios auditivos de camundongos nos primeiros estágios pós‐natais. No entanto, vale a pena notar que, conforme relatado em estudos com CTPis humanas, os níveis de expressão de mRNA observados sempre foram variáveis entre diferentes linhagens de CTPis humanas, entre amostras das mesmas linhagens e também quando CTPis foram comparadas com CTEs humanas controles. Essa variação, como sugerido pelos autores, pode estar relacionada a mutações genéticas e epigenéticas resultantes da integração aleatória de lentivírus no genoma durante o processo de indução de pluripotência.

Após a padronização do processo de diferenciação neuronal descrito acima, os autores continuaram com a avaliação da viabilidade dos neurônios sensoriais diferenciados das duas linhagens diferentes de CTPis na inervação de células ciliadas ex vivo.37 Após 10 dias de cocultura, os progenitores neurais foram capazes de emitir projeções em direção às células ciliadas do explante coclear com eficiência de até 94,2% e de forma desordenada, um padrão de ramificação semelhante ao observado nos neurônios auditivos no início do desenvolvimento. Os ensaios de imunofluorescência também revelaram sinapses entre os neurônios derivados das CTPis e as células ciliadas, como indicado pela expressão da sinapsina‐1. Por fim, os autores observaram que os neurônios menos diferenciados (21 dias de diferenciação in vitro) apresentavam mais sinapses com maior número de células ciliadas quando comparados com os neurônios mais diferenciados (28 dias de diferenciação in vitro), mostrando a importância da fase de diferenciação dos progenitores neurais escolhida para a maximização da integração funcional dessas células no tecido coclear.

Quanto à diferenciação de CTPis em células ciliadas, um elegante trabalho foi conduzido por Oshima et al. (2010).38 As CTPis derivadas de fibroblastos de camundongos transgênicos Atoh1/nGFP foram cultivadas por cinco dias com um inibidor da via Wnt, um inibidor de Smad3 e IGF‐1, seguido de exposição a bFGF por três dias. Os progenitores óticos foram obtidos e depois diferenciados em células ciliadas através de cocultura com células estromais de utrículo de galinhas mitoticamente inativadas. A eficiência global de diferenciação de células ciliadas, no entanto, foi baixa: cerca de 12% das células ciliadas derivadas de CTPis expressaram MYO7a, enquanto apenas 2,6% expressaram MYO7a e espina. Estas células ciliadas derivadas da CTPis eram morfológica e eletrofisiologicamente semelhantes às células ciliadas imaturas. Finalmente, experimentos de co‐cultura revelaram que gânglios neurossensoriais coletados de camundongos neonatos emitiram projeções neurais em direção às células ciliadas derivadas de CTPis, com formação de sinapses confirmada pela expressão de sinaptosina (SYN). Por outro lado, Chen et al. (2018)39 obtiveram mais sucesso na obtenção de células ciliadas derivadas da CTPis humanas. Esses autores submeteram CTPis derivadas de células urinárias humanas ao mesmo protocolo de diferenciação de células ciliadas usado para CTEs,15 obtiveram PEOs que, após o uso de condições de cultura de “células ciliadas”, produziam células semelhantes a células ciliadas com até 50% de eficiência. Experimentos in vitro mostraram que os neurônios do gânglio espiral murino eram capazes de emitir projeções neurais em direção às células com fenótipo semelhante a células ciliadas derivadas de CTPis humanas e formar sinapses. Por fim, pela primeira vez na literatura, essas PEOs derivadas de CTPis humanas foram transplantadas para camundongos Slc26a4‐null, animais que sofrem perda auditiva devido à perda da função da pendrina, o que prejudica a funcionalidade das células ciliadas. Quatro semanas após o transplante, novas células ciliadas foram identificadas no órgão de Corti, embora em números extremamente pequenos. Apesar de não conseguirem se organizar de forma regular como as células ciliadas nativas, as células transplantadas expressaram MYO7a e foram alvo de neurônios de gânglios espirais nativos para sinapses. Infelizmente, os animais transplantados não foram submetidos à avaliação funcional para verificar se houve melhoria da audição.

Não há dúvidas sobre o enorme potencial da terapia celular no tratamento de diversas patologias que requerem a regeneração de células e tecidos danificados, como doenças neurodegenerativas,40 distrofias musculares41 e surdez. Além dos obstáculos mais óbvios a serem superados, que incluem a possibilidade de formação de tumor e a rejeição de células transplantadas pelo sistema imune do receptor, outros aspectos importantes sobre o sucesso de uma terapia direcionada à surdez também devem ser levados em consideração.

O primeiro ponto é a eficiência da diferenciação das CT transplantadas em células ciliadas ou neurônios auditivos. Apesar do constante aumento do conhecimento sobre biologia molecular e desenvolvimento embrionário da orelha interna e seus tipos celulares específicos, é geralmente observado uma eficiência de diferenciação muito limitada para os tipos celulares desejados. Entretanto, tem‐se trabalhado para superar essa adversidade, seguindo o exemplo de Liu et al. (2015),42 que, com base em estudos de perfis de expressão gênica durante todos os estágios de diferenciação de células ciliadas, foram capazes de identificar conjuntos de marcadores moleculares específicos para CTOI, células progenitoras e células ciliadas. Isso deve aumentar significativamente a eficiência na identificação e diferenciação de CT em células ciliadas maduras.

O segundo ponto é a sobrevivência das células transplantadas após sua inserção na cóclea dos pacientes, pois isso influenciaria o número de transplantes necessários para obter e manter a recuperação auditiva final desejada. Até o momento, os transplantes foram feitos apenas em modelos animais para a regeneração de neurônios auditivos e a maior taxa de sobrevivência foi de 94% das células transplantadas, 10 semanas após o transplante.21

Um terceiro ponto que deve ser considerado é a integração funcional das CT transplantadas para o sistema auditivo do paciente. Por enquanto, entre todos os estudos de transplante para regeneração de neurônios auditivos, apenas um apresentou dados quantitativos sobre essa questão, em que, no grupo de 50% de células transplantadas que sobreviveram uma semana após o transplante, apenas 2,3% expressaram um marcador glutamatérgico neural de neurônios auditivos.43

Finalmente, há outras questões levantadas de maneira brilhante por alguns autores,44,45 as quais merecem investigação futura, tais como (i) de que maneira as células transplantadas se distribuirão ao longo do duto coclear e regenerarão o órgão de Corti, (ii) a possibilidade de que a endolinfa, o líquido que preenche o compartimento que abriga o órgão de Corti, possa ser tóxica para as células transplantadas devido ao seu alto teor de potássio; (iii) o fato de que, para uma integração bem‐sucedida das células transplantadas, há a necessidade de uma quebra na adesão celular entre as células ciliadas e as células de suporte remanescentes no órgão de Corti; e (iv) no caso de regeneração das células ciliadas, existe a possibilidade de as CT se integrarem ectopicamente na cóclea e prejudicarem a função coclear. É necessário que as células transplantadas se integrem e se posicionem corretamente na membrana basilar, para que possam ser corretamente ativadas, um fato bastante improvável considerando a alta complexidade da citoarquitetura do órgão de Corti.