Foram incluídos no estudo 48 ratos machos Wistar albinos adultos com peso de 250g a 280g após teste de emissão otoacústica evocada por produto de distorção (EOAPD) para confirmar a normalidade de sua audição. Todos os procedimentos de intervenção foram feitos sob anestesia, que foi induzida com 50mg/kg de cloridrato de cetamina aplicado intraperitonealmente (Ketalar®, Eczacıbaşı Parke‐Davis, Istambul, Turquia) e 10 mg/kg de cloridrato de xilazina (Alfazyne®, Alfasan International B.V., Woerden, Holanda). As temperaturas retais dos ratos foram medidas regularmente enquanto os ratos estavam sob anestesia e cobertas aquecidas que mantinham as temperaturas corporais dos ratos a cerca de 35°C foram colocadas sobre eles. Os ratos com valores de razão sinal‐ruído (RSR) de 3dB ou mais em três das cinco frequências avaliadas no teste de EOAPD foram considerados com um nível auditivo normal. Durante o estudo, os ratos foram mantidos na unidade experimental animal, com 12h de luz e 12h de escuridão a cada dia, a uma temperatura ambiente de 22° ± 3°C e umidade de 55% a 60%. Permitiu‐se aos animais consumir alimentos e água da torneira ad libitum. Em todas as etapas do estudo, o meato acústico externo e as membranas timpânicas dos ratos foram examinados otoscopicamente para excluir outros fatores que poderiam influenciar os resultados do teste, como cerume, sinais de infecção ou perfuração da membrana timpânica.

Os ratos foram divididos aleatoriamente em seis grupos de oito animais. As investigações auditivas foram feitas através de um teste EOAPD no início e no oitavo dia do estudo. Os grupos de estudo foram tratados da seguinte forma: o primeiro grupo (grupo controle, n = 8) não foi exposto a intervenção, exceto ao teste de EOAPD. O segundo grupo (grupo simulado, n = 8) recebeu solvente intraperitoneal (i.p.) (água destilada + metanol) durante oito dias. O terceiro grupo (grupo controle de uva‐do‐monte, n = 8) recebeu extrato de uva‐do‐monte i.p. (100mg/kg) por oito dias. O quarto grupo (grupo cisplatina, n = 8) recebeu uma dose única de cisplatina i.p. 16mg/kg (cisplatina DBL 100mg/flaconete de 100mL, Orna İlaç, Istambul) no quinto dia. O quinto grupo (grupo cisplatina + 100mg/kg de uva‐do‐monte, n = 8) recebeu extrato de uva‐do‐monte i.p. (100mg/kg) durante oito dias e uma dose única de 16mg/kg de cisplatina i.p. no quinto dia. O sexto grupo (grupo cisplatina + 200mg/kg de uva‐do‐monte, n = 8) recebeu i.p. extrato de uva‐do‐monte (200mg/kg) durante oito dias e uma dose única de 16mg/kg de cisplatina i.p. no quinto dia.

O extrato de uva‐do‐monte (Vaccinium myrtillus Herbal Liquids, Health Aid, Inglaterra) com uma mistura de 50% de água semidestilada e 50% de etanol com 330mg/mL de extrato de uva‐do‐monte foi usado como um produto de apoio nutricional. O produto foi extradiluído em condições estéreis com uma mistura de água semidestilada e etanol para atingir uma concentração de uva‐do‐monte de 50mg/mL.

O registro do EOAPD foi feito com ‐se um conjunto Echoport ILO292‐II (Otodynamics, Hatfield, Inglaterra) configurado para o modo EOAPD em uma sala silenciosa. Depois de manter a cabeça de cada rato na posição horizontal, uma sonda pediátrica foi anexada ao meato acústico externo dos animais. As medições foram obtidas depois de confirmar que o dispositivo estava na posição de medição adequada com a configuração apropriada do indicador da sonda e da forma de onda do estímulo. A razão entre as frequências f2 e f1 (f2/f1) foi mantida em 1,22. A intensidade do estímulo foi tomada como L1 para a frequência f1 e como L2 para a frequência f2. A diferença entre os níveis de L1 e L2 foi mantida em 10 Db NPS (nível de pressão sonora) (L1 = 65dB NPS, L2 = 55dB NPS). Os resultados foram mostrados na média geométrica dos tons primários (f1 e f2). As emissões otoacústicas foram criadas com dois alto‐falantes diferentes para os dois estímulos (f1 e f2) no meato acústico externo. Os EOAPDs foram medidos na frequência 2f1‐f2 com um microfone no meato acústico externo. As emissões otoacústicas resultantes foram registradas com a média geométrica de f1 e f2 em 2000, 3000, 4000, 6000 e 8000Hz. A duração do teste foi de cerca de 60 segundos. Os valores das amplitudes de EOAPD que estavam 3dB acima do limiar de ruído foram considerados significativos. As curvas de frequência SNR foram obtidas. Os valores da razão sinal‐ruído (RSR) de todos os grupos obtidos durante o teste EOAPD foram comparados intra e entre grupos.

Foram coletadas amostras de sangue cardíaco de todos os grupos enquanto os animais estavam sob anestesia no fim do estudo. Após a centrifugação dessas amostras a 3.500rpm durante cinco minutos, os níveis do estado antioxidante total (EAT) e do estresse oxidativo total (EOT) das amostras foram medidos com um autoanalisador (Abbott C16000, Abbott Diagnostics, Abbott Park, IL, EUA) com o uso dos kits Rel Assay Total Antioxidant Status e Total Oxidant Stress Test (Mega Tıp, Gaziantep, Turquia) no laboratório de bioquímica de nossa instituição.

O método de medição do EAT baseou‐se no princípio de que a cor do radical catiônico colorido ácido 2,2’‐azino‐bis (3‐etilbenzotiazolina‐6‐sulfônico) (ABTS) é perdida como resultado da redução de ABTS em proporção à concentração total de moléculas antioxidantes. Os resultados das medições foram expressos como mmol equivalente de Trolox/L.10

Na medida do nível de oxidante total, usou‐se o método colorimétrico, que se baseou no princípio da oxidação cumulativa do íon ferroso para o íon férrico pelas moléculas oxidantes.11

O índice de estresse oxidativo (IEO) foi calculado com a fórmula:

Todos os animais foram sacrificados para avaliação histopatológica após o último teste de EOAPD e coleta de amostras de sangue. O osso temporal foi dissecado e a bula foi aberta. A parede lateral da cóclea foi removida e a cóclea foi fixada com uma solução de 2,5% de glutaraldeído após uma injeção lenta. Os ossos temporais foram mantidos na mesma solução a +4°C durante a noite. Após a fixação, os ossos temporais foram colocados em uma solução de 10% de EDTA a + 4°C durante dez dias para descalcificação. Após esse procedimento, os espécimes cocleares foram desidratados com etanol e embebidos em blocos de parafina. Em seguida, foram preparados cortes com uma espessura de 5μm e corados com hematoxilina‐eosina. Pelo menos 15 amostras de cada cóclea foram examinadas de cada rato. Sinais de degeneração, como dilatação, células apoptóticas, degeneração celular, degeneração nervosa e vacuolização citoplasmática, foram analisados separadamente por um histopatologista cegado para as informações dos grupos. Cada rato foi classificado em uma escala de cinco pontos que variou de 0 a 4 para sinais de degeneração (0: normal, 1: leve, 2: moderado, 3: moderado a grave e 4: grave).

Os dados foram analisados com o software SPSS, versão 15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Os resultados foram apresentados como médias ± erro‐padrão de medida. Todos os dados foram analisados por teste de análise de variância (Anova) com um fator e teste de Bonferroni (post‐hoc). Um valor de p < 0,05 foi considerado como indicativo de uma diferença significante.

O teste de EOAPD foi feito nos animais de todos os grupos antes do início do estudo e os valores basais da RSR foram obtidos em cada frequência. No oitavo dia do estudo, um teste de EOAPD foi feito novamente e os valores da RSR foram registrados. Os valores da RSR obtidos para 2000, 3000, 4000, 6000 e 8000Hz no início e no fim do estudo foram comparados intra e entre grupos. Não houve diferença significante entre os grupos nas medidas do teste de EOAPD feitas no primeiro dia (p > 0,05). No entanto, em comparação com o primeiro teste, os valores da RSR do grupo cisplatina foram significantemente menores em todas as frequências no oitavo dia (p < 0,01). Da mesma forma, os valores da RSR do grupo cisplatina foram inferiores aos dos outros grupos em todas as frequências no oitavo dia (p < 0,015 para 2000, 3000 e 4000Hz, p < 0,001 para 6000 e 8000Hz).

Não houve diminuição significante nos valores de RSR no oitavo dia nos grupos que receberam cisplatina com extrato de uva‐do‐monte (p > 0,05). Esses resultados mostram que o extrato de uva‐do‐monte tem um efeito protetor contra a ototoxicidade induzida por cisplatina. No entanto, não houve diferença significante entre os grupos tratados com cisplatina + 100mg/kg de extrato de uva‐do‐monte e cisplatina + 200mg/kg de extrato de uva‐do‐monte em termos de proteção auditiva (p > 0,05).

Os valores médios da RSR em todos os grupos no primeiro dia e os valores da RSR médios de acordo com cada grupo no oitavo dia são apresentados na figura 1.

Figura 1.

Valores médios da razão sinal‐ruído para todos os grupos.

(0,12MB).

Os valores de EAT obtidos a partir da avaliação bioquímica estão resumidos na tabela 1. De acordo com os dados obtidos, os valores de EAT no grupo de controle com uva‐do‐monte (p < 0,001) e no grupo cisplatina + 200mg de uva‐do‐monte (p = 0,002) foram significantemente maiores do que os do grupo controle. Não houve diferença significante entre os outros grupos e o grupo controle.

Os dados do EOT dos grupos estão resumidos na tabela 2. Os valores de EOT do grupo cisplatina (p = 0,001) e o grupo cisplatina + 100mg de uva‐do‐monte (p = 0,015) foram significantemente maiores do que os do grupo controle (p < 0,05). Não houve diferença significante entre os demais grupos e o grupo controle (p > 0,05).

Os valores calculados do IEO dos grupos estão resumidos na tabela 3. O valor do IEO do grupo cisplatina (p < 0,001) e do grupo cisplatina + 100mg de uva‐do‐monte (p = 0,031) foram significantemente maiores do que os do grupo controle. Não houve diferença significante entre os demais grupos e o grupo controle (p > 0,05).

A estrutura geral do grupo controle mostrou achados histológicos normais na avaliação em microscópio ótico (fig. 2A‐C).

Figura 2.

Grupo de controle: LBE, limbus espiral; o, osso; mR, membrana de Reissner; Dv, duto vestibular; Dc, duto coclear; Ct, canal timpânico; ponta de flecha redonda, membrana basilar; flecha curva, membrana tectorial; Cc, célula ciliada interna; Nc, nervo coclear; Ev, estria vascular; Lge, ligamento espiral; Ge, gânglio espiral; seta preta, células ganglionares espirais (coloração hematoxilina eosina, × 40).

(0,26MB).

Os grupos controle simulado e uva‐do‐monte também mostraram estruturas histológicas normais ao exame com microscópico ótico. Não foram identificados efeitos positivos ou negativos nas estruturas celulares e na morfologia.

A avaliação por microscopia ótica do grupo cisplatina revelou que a estrutura geral do tecido se deteriorou. Foram observados aumento da vacuolização citoplasmática e separação celular degenerativa. Embora o órgão de Corti tenha mantido sua integridade, a extensão e o corpo celular das células ciliadas internas e externas mostraram edema local e separação degenerativa.

Os núcleos das células mostraram‐se ligeiramente acidófilos e seu citoplasma mostrou vacuolização. A membrana tectorial estava engrossada, com morfologia normal, enquanto a membrana de Reissner mostrou células com edema e separação celular. Embora os núcleos das células de suporte fossem ligeiramente basofílicos, uma pequena quantidade de vacuolização foi observada em seu citoplasma. A vacuolização na região do limbo espiral mostrou as separações como dilatação (fig. 3A). As células que formam a estria vascular e o ligamento espiral eram patológicas em comparação com o grupo controle em termos de matriz e aparência do núcleo. Foram detectadas dilatações e perda de núcleo devido à degeneração celular. O aumento da vacuolização e algum grau de degeneração das células foram observados na estria vascular e no ligamento espiral. Havia células dilatadas no limbo espiral e elas eram intensamente acidófilas (fig. 3B). O gânglio espiral e as fibras nervosas cocleares estavam um pouco degenerados. Foram identificados um aumento da vacuolização e degeneração axonal. A deformação dos corpos celulares foi observada em neurônios pseudounipolares com uma pequena quantidade de vacuolização (fig. 3C).

Figura 3.

Grupo cisplatina: mR, membrana de Reissner; Dv, duto vestibular; Dc, duto coclear; ponta da flecha curva, membrana basilar; d, degeneração e dilatação; v, vacuolização; seta curva, membrana tectorial; Nc, nervo coclear; Ev, estria vascular; Lge, ligamento espiral; Ge, gânglio espiral; seta preta, células ganglionares espirais (coloração hematoxilina eosina, × 40).

(0,23MB).

Embora as comparações dos grupos cisplatina + 100mg/kg de uva‐do‐monte e cisplatina + 200mg/kg de uva‐do‐monte com o grupo controle apresentassem achados de degeneração, esses não foram graves como os do grupo cisplatina (figuras 4‐5).

Figura 4.

Grupo cisplatina + 100mg/kg uva‐do‐monte; mR, membrana de Reissner; Dc, duto coclear; ponta da flecha curva, membrana basilar; cid, célula interdental; Cc, célula ciliada interna d, degeneração e dilatação; seta curva, membrana tectorial; Nc, nervo coclear; Ev, estria vascular; Lge, ligamento espiral; Ge, gânglio espiral; seta preta, células ganglionares espirais (coloração hematoxilina eosina, × 40).

(0,22MB).

Figura 5.

Grupo cisplatina + 200mg/kg uva‐do‐monte; mR, membrana de Reissner; Dv, duto vestibular; Dc, duto coclear; ponta da flecha curva, membrana basilar; d, degeneração e dilatação; v, vacuolização; seta curva, membrana tectorial; Nc, nervo coclear; Ev, estria vascular; Lge, ligamento espiral; Ge, gânglio espiral; seta preta, células ganglionares espirais (coloração hematoxilina eosina, × 40).

(0,22MB).

Os resultados da classificação histopatológica cegada para as informações dos grupos, de acordo com os achados de dilatação, células apoptóticas, degeneração nervosa, degeneração celular e vacuolização citoplasmática, estão resumidos na tabela 4. De acordo com os resultados da classificação histopatológica cegada, não foi observada diferença significante entre o controle grupo e os grupos controle simulado e uva‐do‐monte em termos de achados de degeneração (p > 0,05). Quando o grupo controle foi comparado com os grupos cisplatina e cisplatina + 100mg/kg, houve diferenças significantes em relação a todos os critérios de avaliação (p < 0,001).