Em nosso estudo, recrutamos consecutivamente 86 pacientes. O diagnóstico se fundamentou principalmente no exame histopatológico. De acordo com métodos prévios,13 os PNs eosinofílicos e não eosinofílicos foram categorizados com base nos resultados imunoistoquímicos (IHQ), pela presença de < 5 ou ≥ 5 eosinófilos/campo de grande ampliação (cga), respectivamente. Os dados basais foram coletados e, em seguida, obtivemos os escores de Lund‐Kennedy e Lund‐Mackey, com o objetivo de avaliar a gravidade dos PNs. Nenhum dos participantes tinha usado corticosteroides orais ou nasais nas quatro semanas anteriores à cirurgia. Os detalhes de todos os participantes estão resumidos na tabela 1. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local (n° 20130106), e os participantes deram consentimento livre e informado.

Cada amostra foi dividida em duas partes: uma foi armazenada a ‐80°C para a análise de mRNAs e proteínas; a outra parte foi empregada na coloração IHQ.

Durante a consulta clínica, os pacientes foram submetidos a uma avaliação geral dos sintomas da rinite. Os sintomas de obstrução e prurido nasal, espirros e rinorreia foram classificados em uma escala de 4 pontos, na qual 0=ausência de sintomas, 1=sintomatologia leve, 2=sintomatologia moderada e 3=sintomatologia grave. Os escores totais para os sintomas variaram de 0 a 12 e representaram o somatório dos escores para bloqueio nasal, prurido nasal, espirros e rinorreia.

Para a imunoistoquímica, as secções foram submetidas a desparafinização e desidratação; em seguida, foram colocadas em H2O2 0,3% durante 20 minutos à temperatura laboratorial, para redução da coloração de fundo inespecífica. Em seguida à recuperação do antígeno em tampão citrato 10 mM durante 15 minutos, procedeu‐se incubação noturna com anticorpo monoclonal anti‐humano para MBP (eosinófilos, 1:100, Santa Cruz), anti‐HNE (neutrófilos, 1:200, Dako) e antitriptase (mastócitos, 1:100, Santa Cruz) a 4°C, respectivamente, para a coloração imunoistoquímica. No dia seguinte, as secções foram lavadas com PBS e incubadas com o anticorpo secundário (Gene Tech, Shanghai, China) à temperatura laboratorial, durante uma hora.

Depois da lavagem, e submetidos a coloração com DAB (Gene Tech, Shanghai, China) sob microscopia, as secções foram contracoradas com hematoxilina de Mayer (Dako) durante 40 segundos, desidratadas seriadamente em etanol, diafanizadas com xilenol (3 vezes) e montadas com bálsamo neutro (Dako). O controle para a coloração inespecífica foi feito rotineiramente com PBS, em lugar dos anticorpos primários; todos os espécimes se revelaram negativos.

As secções foram visualizadas com um microscópio Olympus CX40 (Olympus Europa GmbH, Alemanha) e o número de células positivas foi contado em campo de grande ampliação (×400). Dez campos foram examinados em cada amostra e, em seguida, calculamos a mediana para cada anticorpo.

A análise de PCR em tempo real foi feita conforme descrição prévia. O mRNA total foi extraído de SIP ou de tecidos da mucosa com o uso do reagente TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Precedeu‐se à transcrição reversa (TR) e o cDNA foi sintetizado a partir de 2 μg de RNA total com uso de um primer oligo (dT) 18 e por transcriptase reversa de M‐MLV (Takara, Syuzou, Shiga, Japão). A expressão do mRNA foi determinada com o uso do Sistema de Detecção ABI PRISM 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e de SYBR Premix Taq™ (Takara). As sequências dos primers estão listadas na tabela 2. As amostras PRISM continham 1×SYBR Green Master Mix, 1,5 μL de 5 μM primers, e 25 ng de cDNA sintetizado em um volume de 25 μL. As reações foram aquecidas a 95°C durante 10min, seguidas por 40 ciclos de desnaturação a 95°C durante 10 seg e com extensão de anelamento a 60°C durante 60 seg. Todas as reações de PCR foram feitas em duplicata. Foi usada a análise da curva de desnaturação para o controle da especificidade da ampliação. O valor médio para os replicados foi calculado para cada amostra e foi expresso como valor de limiar de ciclo (Ct). A expressão relativa de cada gene‐alvo foi determinada como a diferença (ΔCt) entre o valor de Ct do gene‐alvo e o valor de Ct da ß‐actina. As mudanças de enovelamento no mRNA do gene‐alvo foram determinadas como 2−ΔΔCt.

A amostra de tecido recém‐obtida foi pesada, foi adicionado um cocktail de inibidores da protease (Keygentec, Nanjing, China) para cada 100mg de tecido. Em seguida, o tecido foi homogeneizado com o uso de um homogeneizador (Kinematica, Suíça) durante um min, em gelo. Depois da homogeneização, a suspensão foi centrifugada a 4000 rpm durante 20 min a 4°C e o sobrenadante foi armazenado a ‐80°C até o momento da análise.

Foram usados kits de ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (Elisa) para a determinação dos níveis teciduais de IL‐5, IL‐4, IL‐13, IL‐17, IL‐23, IL‐8 e MPO (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), em conformidade com os protocolos do fabricante. Cada amostra foi testada em duplicata. Os limites de detecção dos testes foram: IL‐5, 3,9 pg/mL; IL‐4, 31,2 pg/mL; IL‐13, 62,5 pg/mL; IL‐17, 31,2 pg/mL; IL‐23, 39 pg/mL; MPO, 1,56 mg/mL; IL‐8, 3,9 pg/mL.

Todos os dados foram expressos como média±DP. A significância estatística entre os dois grupos foi determinada com a aplicação do teste U de Mann‐Whitney. Consideramos p<0,05 como representativo de diferença significante.

Com base em nossos critérios histológicos, 46 pacientes com PNs (53,5%) foram classificados no subgrupo eosinofílico e 40 com PNs (46,5%) foram classificados no subgrupo não eosinofílico. As características demográficas e clínicas dos pacientes estão listadas na tabela 1. Em comparação com os pacientes com PNs não eosinofílicos, aqueles com PNs eosinofílicos apresentaram duração mais prolongada dos sintomas, contagem absoluta de eosinófilos mais alta, níveis sanguíneos de IgE mais altos, maior percentual de história de alergia, maior proporção de eosinófilos, escores de Lund‐Kennedy e Lund‐Mackey mais altos, maiores tempos cirúrgicos e escores mais altos para a sintomatologia. Em termos de idade e gênero, não houve diferença significante entre pacientes com PNs eosinofílicos e não eosinofílicos.

Constatou‐se que o número de células inflamatórias totais em PNs eosinofílicos aumentou significantemente, em comparação com PNs não eosinofílicos (dados não apresentados). Com relação aos tipos celulares, os PNs eosinofílicos exibiam maior número de mastócitos, exceto para eosinófilos, enquanto os PNs não eosinofílicos apresentavam maior infiltração por neutrófilos (tabela 3). Nossos resultados também demonstraram que 85% dos PNs eosinofílicos tinham mais de seis mastócitos por cga, enquanto todos os PNs não eosinofílicos tinham menos de três mastócitos por cga. Por outro lado, os PNs não eosinofílicos exibiam grande infiltração por neutrófilos. No total, 90% dos PNs não eosinofílicos tinham mais de cinco mastócitos por cga, enquanto todos os PNs eosinofílicos tinham menos de dois neutrófilos por cga. Também analisamos a relação entre o número de eosinófilos e outras células e constatamos que o número de eosinófilos tinha correlação positiva com o número de mastócitos (r=0,68; p<0,001) e com o total de células inflamatórias (r=0,46; p<0,05); mas não observamos relação entre eosinófilos e neutrófilos.

Nos PNs eosinofílicos, observamos expressão mais alta de fatores de transcrição e de citocinas de Th2 (GATA‐3, IL‐5, IL‐4, IL‐13), enquanto que nos PNs não eosinofílicos observamos expressão mais alta para os fatores de transcrição e citocinas de Th17 (RORc, IL‐17A, e IL‐23) (fig. 1). Para os fatores de transcrição e citocinas de Th1 (T‐bet e IFN‐γ), não observamos diferença entre os dois grupos (dados não apresentados).

Figura 1.

Comparação da expressão de mRNA entre PNs eosinofílicos e não eosinofílicos.

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De maneira similar ao que ocorreu com a expressão de mRNA, as citocinas de Th2 (IL‐5 e IL‐13) estavam significativamente mais altas nos PNs eosinofílicos e as citocinas de Th17 (IL‐17A e IL‐23) estavam significativamente mais altas nos PNs não eosinofílicos (fig. 2). Contudo, não foi possível detectar a expressão da proteína IL‐4 em ambos os grupos (dados não apresentados). Em relação à expressão das citocinas de Th1 (IL‐12 e IFN‐γ), não foram observadas diferenças entre os dois grupos (dados não apresentados). Além disso, a expressão de marcadores de neutrófilo (IL‐8, MPO) estava mais alta em PNs não eosinofílicos vs. eosinofílicos. Na análise da relação entre expressão das citocinas, observou‐se que IL‐17A apresentava correlação positiva tanto com a expressão de IL‐8 como de MPO (r=0,53, p<0,01; r=0,57, p<0,05).

Figura 2.

Comparação da expressão de proteínas entre PNs eosinofílicos e não eosinofílicos.

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